共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究

【摘要】一、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养目的：探索人骨髓间充质干细胞（humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs）与人软骨细胞（humanArticularChontrocytes，hACs）的体外分离及培养过程，并对其进行鉴定；尝试利用转化因子β1（Transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）诱导hBMSCs向软骨细胞分化。方法：取5～8岁儿童四肢长骨骨折需髓内钉固定者，抽吸其钻孔后流出的骨髓，通过分离、离心获得细胞，采用低糖DMEM培养基进行体外培养，采取流式细胞仪对培养的细胞进行鉴定；使用倒置显微镜观测细胞形态及生长状况，绘制hBMSCs生长曲线。利用TGF-β1诱导hBMSCs向软骨细胞分化。对诱导后的细胞进行阿利新蓝染色、蕃红花-亮绿染色检测细胞蛋白聚糖﹙Aggrecan，GAG），免疫组织化学染色检测II型胶原。取多指（趾）患儿切除下来的关节软骨，分离、消化获得软骨细胞，鉴定同hBMSCs诱导软骨细胞。结果：hBMSCs呈现贴壁生长，约2ml骨髓中获得的hBMSCs经10天左右可长满六孔板的一孔。传代后，其第一代～第五代生长旺盛，培养至二十代渐出现凋亡。第三代hBMSCs经流式细胞仪检测CD34、CD45表达阴性，CD29表达阳性。利用TGF-β1诱导后的hBMSCs其阿利新蓝、蕃红花-亮绿及免疫组化II型胶原染色表达阳性。多指（趾）软骨细胞2周长满六孔板的一孔。鉴定结果同hBMSCs诱导软骨细胞。结论：1、在体外成功分离、培养了hBMSCs和hACs。2、hBMSCs可来源于5～8岁儿童四肢长骨骨髓。3、成功利用转化因子β1诱导hBMSCs分化成软骨细胞。二、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨目的：研究hACs与hBMSCs直接接触共培养的最佳比例；比较混合培养与TGF-β1诱导hBMSCs体外构建组织工程软骨的效果。方法：取上述分离培养后第三代hBMSCs和第三代hACs以2：1、1：1、1：2的比例共培养并接种于丝素蛋白支架（实验组A、B、C）。同时建立诱导剂诱导第三代hBMSCs向软骨细胞分化并接种于丝素支架的对照组D；建立单纯第三代hACs接种于丝素支架的对照组E。保持各组细胞总数一致。将细胞-支架复合物进行体外培养3周，采用倒置显微镜、大体形态、组织学HE染色、II型胶原染色、阿利新蓝比色法测GAG含量及Hoechst33258荧光法行DNA定量分析进行观察。结果：各组细胞在丝素蛋白三维支架上均生长良好；各组细胞支架复合物外观大小无明显差异。A组（hBMSCs：hACs=2：1）与D组（TGF-β1诱导组）形成的细胞支架复合物弹性、光泽较差，组织学染色见细胞增殖少，细胞外基质分泌水平较低，GAG与DNA定量分析结果低于其他三组。C组（hBMSCs：hACs=1：2）构建的细胞支架复合物具有最佳的弹性与光泽，组织学染色见细胞支架结合紧密，细胞增殖较多，胞外基质丰富，GAG与DNA定量分析结果最高。B组（hBMSCs：hACs=1：1）与E组（单纯hACs组）体外构建的组织工程软骨质量相当。结论：1、hBMSCs与hACs之间的相互作用有利于软骨细胞外基质的产生，比例为2：1时即可获得与TGF-β1诱导hBMSCs相当的成软骨效应。2、hBMSCs与hACs直接接触共培养比例为1：2时具有最佳的成软骨效应。
【作者】刘尧；
【导师】王晓东；张亚；
【作者基本信息】苏州大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】骨髓间充质干细胞；软骨细胞；诱导；组织工程软骨；共培养；

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